Dossier DNA

Nieuws

DNA-bank

Klonen

Humane Genoom

Chromosomen

Knagende kloon; VOLWASSEN MUIZEN GEKLOOND VIA KERNTRANSPLANTATIE

Marcel aan de Brugh Voor het eerst zijn er volwassen muizen gekloond via kerntransplantatie, de techniek waarmee Dolly werd geboren. Erg efficiënt is de methode nog niet.

Eindelijk is bewezen wat lang voor onmogelijk werd gehouden: volwassen muizen zijn wel degelijk te klonen via kerntransplantatie, de techniek waarmee Dolly ter wereld werd gebracht. Een groep onderzoekers uit Hawaii, Japan, Engeland, Italië en Amerika is daar nu in geslaagd. Hun resultaten werden afgelopen donderdag in Nature gepubliceerd.

Het internationale team wist in totaal 31 muizen te klonen. Ze gebruikten daarvoor de inmiddels bekende techniek van kerntransplantatie. Daarbij neemt een onderzoeker een volwassen cel uit een dier, zeg een zwarte muis. Uit die cel haalt hij de kern en die brengt hij in een eicel van zeg een witte muis, waaruit eerder al de kern is verwijderd. Daarna krijgt de eicel het signaal dat hij zich moet gaan delen. Er ontstaat een embryo. Dat wordt vervolgens in een draagmoeder geplaatst. Daarna is het wachten op de geboorte.

Om die 31 klonen te krijgen voerden de onderzoekers 2.468 kerntransplantaties uit. Dat leverde 1.385 embryo's op. Die werden in 90 draagmoeders geplaatst. Uit deze cijfers blijkt dat de efficiëntie van de techniek nog steeds erg laag is. Het feit dat volwassen muizen nu te klonen zijn, biedt echter interessante perspectieven, meent prof.dr. A. Berns, hoofd van de afdeling moleculaire genetica van het Nederlands Kanker Instituut. “Het kan van pas komen bij het oplossen van fundamentele vragen, met name over de genetische programmering van cellen. Het is praktisch om dat bij de muis te bestuderen. Een muis is een bekend proefdier, laat zich makkelijker houden en heeft een korte generatietijd.”

Uit het onderzoek blijkt dat niet alle cellen even geschikt zijn voor klonen. De wetenschappers begonnen hun experimenten met drie verschillende typen cellen: Sertoli-cellen, neuronale cellen en cumulus-cellen. Sertoli-cellen bevinden zich in de testis. Ze liggen langs de zaadbuizen en zijn betrokken bij de aanmaak van zaadcellen. Neuronale cellen zijn zenuwcellen. Cumuluscellen vormen een dikke laag om een ontwikkelende eicel en voorzien haar van voedingsstoffen, onder andere koolhydraten. Kerntransplantatie lukte het beste met kernen uit cumulus-cellen. Van alle eicellen met een 'cumulus-kern' groeide ruim 60 procent uit tot een embryo: van de eicellen met een Sertoli-kern was dat 40 procent en van de eicellen met een kern uit een neuronale cel lag dat percentage op 22. De auteurs hebben geen verklaring voor deze verschillen. Vanwege hun succes zijn verdere experimenten uitgevoerd met cumulus-cellen. De eerste gekloonde muis werd op 3 oktober 1997 geboren, een half jaar nadat Nature het artikel over Dolly had gepubliceerd. Het dier kreeg de naam Cumulina.

Tot voor kort werd het klonen van volwassen muizen voor onmogelijk gehouden. Karl Illmensee en Peter Hoppe beweerden in 1981 dat het hun was gelukt. In januari van dat jaar publiceerden ze hun resultaten in Cell. Het nieuws sloeg in als een bom. Illmensee, de meest charismatische van de twee, was op slag wereldberoemd. Maar niemand slaagde er vervolgens in om de resultaten te herhalen. De Duitser werd beticht van fraude. Een vijfkoppige commissie werd aangesteld om de kwestie tot op de bodem uit te zoeken. In 1983 concludeerde de commissie dat Illmensee tijdens zijn experimenten onacceptabel veel fouten had gemaakt. Zijn proeven werden “wetenschappelijk waardeloos” genoemd. Illmensee werkt nu bij de gynaecologische kliniek aan de universiteit van Salzburg, Peter Hoppe trok zich drie jaar geleden uit de wetenschap terug. Hij was toen 53.

In 1984 schreven James McGrath en Davor Solter in Science: “Het klonen van zoogdieren, via een eenvoudige kerntransplantatie, is biologisch onmogelijk.” Dertien jaar later, met de geboorte van Dolly, moesten McGrath en Solter die uitspraak intrekken. Het Schotse schaap is een kloon, voortgekomen uit een uiercel van een zes jaar oude zwangere Fin Dorset ooi. Een uiercel is een zogeheten gedifferentieerde cel, genetisch helemaal erop toegespitst om te functioneren als een uiercel. Het is opmerkelijk dat het de Schotten gelukt is om een uiercel te herprogrammeren, zodat er weer een heel zoogdier - met spierweefsel, bindweefsel, huidweefsel, enzovoorts - uit groeit. Toch hebben sceptici altijd getwijfeld aan de uitkomst van de proef. Volgens hen is het gewoonweg niet mogelijk om een gedifferentieerde cel te herprogrammeren alsof hij weer helemaal aan het begin van zijn ontwikkeling stond.

Met het klonen van volwassen muizen is die sceptici nu de mond gesnoerd (zie kader). Gedifferentieerde cellen zijn wel degelijk genetisch opnieuw te programmeren zodat ze zich weer als naďeve cellen gedragen. Berns: “De differentiatie is een zeer complex proces. Sommige genen worden uitgeschakeld, andere blijven actief. Welke dat precies zijn is afhankelijk van de taak die een cel moet gaan vervullen. Een gen dat moet worden uitgeschakeld, wordt door de cel gemethyleerd. Die plakt op verschillende plaatsen een methylgroep (CH) aan het DNA waardoor het gen niet meer kan worden afgelezen. Het DNA van een gedifferentieerde cel, bijvoorbeeld een cumulus-cel, barst van die methylgroepen. Bij kerntransplantatie worden die methyleringen ongedaan gemaakt.”

Voor een goede herprogrammering is het essentieel dat de activiteit van de donorkern en de ontvangende eicel op elkaar worden afgestemd. Dat gebeurt door de donorcellen een aantal dagen te bewaren in kweekvloeistof waarin de concentratie voedingsstoffen langzaam afneemt. De cellen komen dan tot rust, ze bevinden zich in de zogenoemde G-fase van de celcyclus. Daarna wordt de kern uit zo'n rustende cel getransplanteerd naar een lege eicel. Enzymen in het celplasma kunnen er dan voor zorgen dat de methylering van het DNA ongedaan wordt gemaakt. Zeker bij de muis is dit van vitaal belang. Het DNA van een bevruchte eicel houdt zich gedurende de eerste celdelingen nog rustig, die delingen voltrekken zich min of meer automatisch. Bij muizen wordt het DNA al in het tweecellig stadium actief, bij schapen pas in het acht- of zestiencellig stadium. Bij de muis is er dus veel minder tijd om het DNA in de kern te herprogrammeren, het is hier dus cruciaal om donorkern en eicel optimaal op elkaar af te stemmen.

Toch denken de auteurs in Nature dat er meer nodig is dan alleen die G-fase. “Blijkbaar is die niet genoeg om de ontwikkeling van een embryo te garanderen”, schrijven ze. Alle drie de celtypen die ze in eerste instantie beproefden bevonden zich vlak voor de kerntransplantatie immers in de rustfase. Toch leverde dat zeer verschillende resultaten op.

Het belang van die G-fase werd onlangs trouwens helemaal in twijfel getrokken door een publicatie in Science (22 mei). Een groep Amerikaanse wetenschappers gebruikte juist actieve cellen voor kerntransplantatie. En hun aanpak werkte. Als donorcellen gebruikten ze foetale fibroblasten. Na kerntransplantatie verkregen ze 276 embryo's. Daarvan groeide 12 procent uit tot blastocyst en daarvan plaatsten de onderzoekers er 28 terug, verdeeld over 11 draagmoeders. Zo'n negen maanden later werden er vier kalveren geboren. Eén stierf er vijf dagen na de geboorte, de rest bleek gezond. De vraag is dus nu hoeveel het er toe doet dat een donorcel zich in de G-fase bevindt voordat de kerntransplantatie wordt uitgevoerd. Berns: “Niemand kan daar een mening over hebben, want niemand weet er het fijne van.”

Berns denkt niet dat het klonen toegepast gaat worden om transgene muizen te maken. “De huidige technieken voldoen daarvoor prima. Het klonen van muizen zal denk ik geen middel worden. Je zou het wel kunnen gebruiken als doel om de herprogrammering van gedifferentieerde cellen te bestuderen.”

De Honolulu-techniek

Het Schotse bedrijf PPL Therapeutics, dat betrokken is geweest bij het maken van kloon Dolly, heeft donderdag een overeenkomst gesloten met ProBio America, een in Honolulu gevestigd bedrijf dat een verbeterde kloontechniek (de Honolulu-techniek) in huis heeft. Met die techniek willen beide bedrijven genetisch gemanipuleerde varkens gaan klonen. Ze willen de varkensorganen gebruiken voor orgaantransplantaties bij mensen. De Honolulu-techniek is een verbetering van de Dolly-methode. Daarbij werden donorkern en eicel met elkaar versmolten via een elektrische puls. Bij de nieuwe techniek wordt de donorkern met behulp van een speciale pipet in de eicel geďnjecteerd. Door toevoeging van bepaalde stoffen wordt de rijping van de eicel vervolgens een tot zes uur vertraagd, zodat kern en celplasma hun activiteit in de tussentijd op elkaar kunnen afstemmen. Deze vertraging vergroot de kans dat de eicel zich normaal gaat ontwikkelen. Deze methode is efficiënter dan de klassieke manier van klonen. PPL Therapeutics probeert al een tijdje genetisch gemanipuleerde varkens te klonen via de Dolly-techniek, maar dat lijkt niet goed te lukken. Het bedrijf hoopt op meer succes met de Honolulu-techniek. Het Schotse bedrijf maakte afgelopen dinsdag trouwens de geboorte van nieuwe transgene lammetjes bekend. In het erfelijk materiaal van de dieren is een menselijk gen geplaatst dat codeert voor het eiwit extracellulair superoxide dismutase (EC SOD). Dit is een natuurlijk anti-oxidant dat zuurstofradicalen inactiveert. PPL Therapeutics bekijkt of EC SOD van nut kan zijn bij het vervoer van organen van donor naar ontvanger. Het eiwit zou eventuele schade aan een orgaan - veroorzaakt door zuurstofradicalen - misschien kunnen verminderen of voorkomen. Ook bij bypass-operaties zou het eiwit van nut kunnen zijn.

Dolly is echt een uiercel

Dolly is écht ontstaan uit een uiercel, zo blijkt uit een publicatie in Nature van afgelopen donderdag. Tot nu toe werd daaraan getwijfeld. Volgens sceptici was de oorsprong van Dolly niet een uiercel, maar een zwervende foetale cel. De zes jaar oude Fin Dorset ooi waaruit de uiercellen werden geďsoleerd, was namelijk zwanger. En het is bekend dat er wel eens foetale cellen in de bloedcirculatie van de moeder belanden. De sceptici denken dat de Schotse onderzoekers per ongeluk zo'n foetale cel hebben opgezogen. Ze kunnen zich moeilijk voorstellen dat een uiercel, die zich genetisch ontwikkeld heeft als uiercel, herprogrammeerd kan worden zodat er weer een zoogdier - met spierweefsel, bindweefsel, huidweefsel, enzovoorts - uit kan groeien.

Om de oorsprong van het Schotse schaap te controleren hebben de makers van Dolly een DNA-analyse uitgevoerd. Ze richtten zich daarbij op microsatelliet-DNA, korte stukjes DNA die vele malen voorkomen in het genoom. Hoeveel, dat verschilt per individu. Het microsatelliet-DNA van een ooi ziet er dus anders uit dan dat van haar lam. Als Dolly van een foetale cel zou stammen, dan was haar DNA voor de helft afkomstig van de moeder en voor de helft van de vader. Haar satelliet-DNA zou dan verschillen van dat van de moeder.

Wetenschappers van het Schotse Roslin Institute en hun collega's van het bedrijf PPL Therapeutics onderzochten het satelliet-DNA van de uiercellen die uit de ooi werden genomen (die opgeslagen liggen in de diepvriezers van het Hannah Research Institute in het Schotse Ayr), van de cellen die in het laboratorium werden gekweekt en van Dolly. Het satelliet-DNA kwam precies overeen. Dolly stamt dus inderdaad van een uiercel. Een soortgelijke test werd ook nog uitgevoerd door onderzoekers in Leicester en in Ayr. Zij kwamen tot dezelfde conclusie.

Foto: Alle deelnemers aan een van de Honolulu-kloonexperimenten bijeen. Linksboven staat de muis die eicellen leverde. Die eicellen werden leeggehaald en daarna gevuld met erfelijk materiaal van de muis rechtsboven. De witte muis was draagmoeder van de uit de gekloonde cellen gegroeide embryo's. De twee muisjes links en rechts van haar zijn haar kinderen, tevens klonen van de muis rechtsboven.